低氧教导因子1(hypoxia inducible factor， HIF-1)动作参与缺氧反应的中枢因子平素存在于动物体内， 它不错调控多种靶基因的抒发。据报说念丝袜 英语， 高级动物HIF能调控100多个基因， 这些基因功能各样， 如调控血管生成、机体氧均衡、能量代谢、细胞凋一火和B淋巴细胞发育等[1-3]。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β两个亚基组成的异源二聚体， 其中HIF-1α亚基对氧气明锐， 在常氧细胞中， 可通过脯氨酸羟化酶和泛素卵白酶体将其降解， 而在低氧环境下， 脯氨酸羟化酶活性被禁绝， HIF-1α融会抒发， 进而参预细胞核内与HIF-1β鸠合成异源二聚体。二聚体复合物与低氧反应原件(hypoxia responsive elements， HREs)鸠合， 再与一些转录因子共同作用调控卑鄙靶基因， 引起机体的生理生化反应[4]。在东说念主(Homo sapiens)、牦牛(Bos grunniens)、高原鼢鼠(Eospalax fontanierii)和大鼠(Rattus norvegicus)等[5-8]高级动物中， 已有许多HIF的报说念。水产动物的干系估量主要麇集在鱼类。如武昌鱼(Megalobrama amblycephala)[9]和胭脂鱼(Myxocyprinus asiaticus)[10]等处于缺氧的环境条目下时， 一些组织中HIF-1α基因的转录水平会显贵上调。河鲈(Perca fluviatilis)、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)也有干系报说念[11-13]。无脊椎动物HIF-1的干系估量较少， 海洋软体动物中只好太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)[14]和杂色鲍(Haliotis diversicolor)[15]等少数几个物种HIF-1基因的干系报说念。Kawabe等[14]通过Northern blot和Western blot分析阐扬， 缺氧条目下太平洋牡蛎HIF-1α mRNA和卵白皆或者被周期性教导抒发。

低氧在海水繁衍环境中通常出现， 常给繁衍生物带来不利影响。天然， 贝类适合缺氧环境的才调相对较强， 但低氧情况下相同会出现免疫下落、滋长受阻和DNA毁伤鄙俚逸， 从而导致滋长速率降速， 生殖力下落， 致使死亡[16]。估量暴露， 贝类不错通过增强氧的输送才调、降粗劣量挥霍、普及能量供应和免疫力等多种生理反应来应答低氧环境[17]。魁蚶(Scapharca broughtonii)是中国弘远埋栖型经济贝类， 主要分散在中国、朝鲜半岛及菲律宾沿海等， 生存在3~50 m水深的软泥或泥沙质海底[18]。赵庆[19]估量标明， 魁蚶的低氧耐受才调较强， 用DO值为0.5 mg/L的条目威迫10 d后， 存活率仍高达15%， 而四角蛤蜊(Mactra quadrangularis)5 d后死亡率即达到90%;魁蚶的鳃、外衣膜和血液中SOD酶活性和T-AOC在低氧威迫后也发生了较大变化， 但其基因层面的反馈限定和调控机制有待潜入估量。

为探究魁蚶HIF-1α的基因结构特征和对低氧的反馈， 本估量克隆赢得了魁蚶HIF-1α基因的cDNA全长， 并对其组织分散、低氧威迫下的抒发进行了估量， 将为揭示魁蚶应答低氧的适合机制提供估量费力， 也为进一步丰富贝类HIF的干系估量提供参考。

1 材料与方法 1.1 现实材料与开始

现实用魁蚶来自于长岛海区， 选取壳长为30 mm傍边的健康个体， 低温运至现实室， 于18℃充气海水中暂养14 d， 每天换水2次， 每次换水量50%， 每4 h投喂单胞藻一次。

1.2 现实解决及现实组织赢得

低氧威迫解决参照赵庆现实方法加以纠正[19]:哄骗调解氮气和空气的充气速率限定DO， 实时监测并截止调解以保证氧浓度安妥现实要求。现实共设4个DO浓度梯度， 诀别为0.5 mg/L、2.5 mg/L、4.5 mg/L和7.5 mg/L(对照组)， 解决0 h、4 h、8 h、16 h、24 h、36 h、48 h和64 h后， 在每组中就地取3个魁蚶的血淋巴、鳃、外衣膜、斧足、闭壳肌和肝胰腺6个组织置于液氮中， 用于RNA索求。基因克隆和组织分散估量材料来自于对照组。

1.3 基因克隆与序列分析 1.3.1 总RNA索求与cDNA合成

RNA索求遴选TRIzol法[20]， 稍加改变。主要武艺为:将组织样品在液氮中研磨， TRIzol解决10 min， 加入氯仿抽提卵白质， 然后再哄骗异丙醇千里淀RNA， 用75%酒精连气儿洗净异丙醇后室温干燥， DEPC水熔化。临了测定RNA浓度和哄骗琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质料、纯度和完满性。哄骗PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(TaKaRa)按照阐述书操作武艺合成cDNA第一链， PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)赢得用于qRT-PCR现实的cDNA第一链， 置于‒20℃中备用。

1.3.2 SbHIF-1α基因克隆

字据现实室已得转录组数据库中的序列， 哄骗Primer 5诀别预备基因的两个特异性引物(HIF-1α-F、HIF-1α-R)扩增SbHIF-1α cDNA的中间片断。字据扩增出的中间片断再诀别预备出两对5'和3'RACE引物(RHIF- 1α-R1、RHIF-1α-R2)和(RHIF-1α-F1、RHIF-1α-F2)使用RACE试剂盒(Clontech)诀别进行巢式扩增赢得基因cDNA全长。第一轮使用试剂盒中的UPM诀别和(RHIF-1α-R1、RHIF-1α-F1)进行四个体系扩增， 再以第一轮扩增产品稀释50倍为模板， 以NUP和(RHIF-1α-R2、RHIF-1α-F2)进行第二轮扩增。第一轮PCR反应规范为94℃ 30 s， 72℃ 1 min， 5个轮回; 94℃ 30 s， 70℃ 30 s， 72℃ 1 min， 5个轮回; 94℃ 30 s， 68℃ 30 s， 72℃ 1 min， 20个轮回; 4℃保存。第二轮PCR反应规范为94℃ 30 s， 68℃ 30 s， 72℃ 2 min， 20个轮回; 72℃ 2 min; 4℃保存。所用引物见表 1。

表 1 基因克隆和荧光定量PCR所用引物序列 Tab.1 The primers used in gene clone and qRT-PCR experiments

用1.2%的琼脂糖胶对PCR产品进行电泳检测， 对认识条带进行切胶回收， 畅达T载体并革新至克隆菌丝袜 英语， 再挑取阳性单克隆菌株， 测序考证。

1.3.3 序列分析

使用SeqMan对测序效果进行拼接， 赢得完满cDNA序列。通过EditSeq软件翻译序列的ORF， 预计卵白分子量大小及等电点; 哄骗Interproscan和Smart在线软件(， -heidelberg.de/)预计编码卵白的功能域; 通过同源建模就业器(SWISS-MODEL)对卵白三级结构进行预计; 经Blast()查找同源序列， 哄骗ClustalX和DnaMan软件进行多序列同源比对， 哄骗Mega 6.0构建系统进化树。

1.4 荧光定量PCR(qRT-PCR)分析

用上述现实所得cDNA稀释15倍后动作qRT-PCR反应模板， 预备特异性引物(QHIF- 1α-F、QHIF-1α-R)， 选用β-actin动作内参基因(表 1)。反应体系为TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL正反向引物各0.8 μL， ROX ReferenceDye Ⅱ(50×) 0.4 μL， 模板2 μL， ddH2O 6 μL。反应规范为: 95℃ 30 s; 95℃ 5 s， 60℃ 34 s， 40个轮回; 95℃ 15 s， 60℃ 1 min， 95℃ 15 s。应用Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System进行qRT-PCR现实， 每个样品作念3个相通， 数据效果遴选2‒ΔΔCt法计较基因的相对抒发量。应用SPSS 17.0软件进行单成分方差分析， P < 0.05时为显贵性相反， P < 0.01时为极显贵相反。遴选GraphPad prism 6.0软件进行作图分析。

2 效果与分析 2.1 基因cDNA序列分析

将测序效果进行拼接比对， 最终得到HIF-1α基因的cDNA全长序列(定名为SbHIF-1α， GenBank登录号为MH936548)(图 1)。

在线伦理片 图 1 SbHIF-1α核苷酸序列及编码氨基酸序列 方框内诀别代表肇始密码子(ATG)和隔断密码子(TGA)， 单下划线的为加尾信号(aataaa)， 双下划线的氨基酸为糖基化位点， 加粗下划线的氨基酸为脯氨酸羟化酶鸠合位点， poly(A)用浪潮线暗意. Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequence of SbHIF-1α The start codon (ATG) and stop codon (TAG) are boxed; polyadenylation signals (aataaa) are underlined with underscore; N-glycosylation sites are double underlined; the proline hydroxylase binding site is overstriking underlined; poly (A) tail are marked by wavy lines.

SbHIF-1α基因cDNA全长为2741 bp， 包括194 bp的5'-UTR， 411 bp的3'-UTR和2136 bp的ORF， ORF编码711个氨基酸残基， 预计卵白分子量为80.8 kDa， 表面等电点为5.57。3'-UTR近poly A隔邻具有加尾信号序列(AATAAA); 软件预计SbHIF-1α含有两个糖基化位点， 一个脯氨酸羟化酶鸠合位点LxxLAP。

2.2 SbHIF-1α的同源性分析

在线比对效果暴露， SbHIF-1α编码的氨基酸序列与其他物种HIF-1α编码的氨基酸序列具有较高相似度， 与杂色鲍、好意思洲牡蛎(C. virginica) HIF-1α的相似度诀别为93%和92%， 与东说念主HIF-1α的相似度也高达77%。序列保守性相对较强， 氨基酸对比信息见图 2。

图 2 不同物种HIF-1α氨基酸序列比对 深色消亡暗意保守的氨基酸残基， 淡色消亡暗意相似的氨基酸残基. 分析所用的氨基酸序列GenBank登录号如下:西伯利亚鲟， KY174955.1;好意思洲牡蛎， HM441076.1;草鱼， AY450269.2;半滑舌鳎， NM_001294187.1;皱纹盘鲍， MH135278.1;东说念主， NM_181054.2;鲢， HM146310.1;团头鲂， GU363498.1;虾夷扇贝， XM_021497943.1;小家鼠， BC026139.1;麦穗鱼， FJ794604.1;非洲爪蟾， NM_001086980.1. Fig.2 Multiple sequence alignment of SbHIF-1α with other hemoglobin amino acid sequences Fully conserved residues are highlighted in dark. Strongly conserved residues among sequences are shaded in light colour. The GenBank accession numbers of protein sequences used for analysis are as follows: Acipenser baerii， KY174955.1; Crassostrea virginica， HM441076.1; Ctenopharyngodon Idella， AY450269.2; Cynoglossus semilaevis， NM_001294187.1; Haliotis discus hannai， MH135278.1; Homo sapiens， NM_181054.2; Hypophthalmichthys molitrix， HM146310.1; Megalobrama amblycephala， GU363498.1; Mizuhopecten yessoensis， XM_021497943.1; Mus musculus， BC026139.1; Pseudorasbora parva， FJ794604.1; Xenopus laevis， NM_001086980.1.

对魁蚶HIF-1α卵白功保守结构域进行分析， 效果见图 3， 魁蚶HIF-1α卵白的N端详对保守， 共有4个保守结构域: 1个HLH结构域， 由第16位氨基酸到第69位氨基酸之间的54个氨基酸残基组成; 2个PAS结构域， 其中PAS-A由第79位氨基酸到第145位氨基酸之间的67个氨基酸残基组成; PAS-B由第214位氨基酸到第280位氨基酸之间的67个氨基酸残基组成; 1个PAC结构域， 由第286位氨基酸到第329位氨基酸之间的44个氨基酸残基组成， 这些保守结构域与图 2深色保守区域相对应。

图 3 魁蚶HIF-1α保守结构域 Fig.3 Domains of hypoxia inducible factor-1α of Scapharca broughtonii

对魁蚶bHIF-1α卵白三级结构进行预计， 如图 4所示。其中一致性最高的区域为22~326位氨基酸残基， 碰巧是两个图 3预计4个保守结构域场所区域。

图 4 魁蚶HIF-1α三级结构 Fig.4 The tertiary structure of hypoxia inducible factor-1α of Scapharca broughtonii

哄骗Mega 6.0软件的Maximum likelihood模子构建的进化树如图 5。本估量中的魁蚶先与虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)聚为一支， 再与杂色鲍和好意思洲牡蛎汇集， 它们的亲缘关系最近， 形成一个相对沉寂的大分支， 接着与脊索动物聚为一支， 而与属节肢动物门的棉铃、拟穴青蟹和中华绒螯蟹的亲缘关系则相对较远。这暴露魁蚶HIF-1α基因的分子进化地位与其生物学分类地位基本一致。

图 5 Maximum likelihood模子构建的SbHIF-1α系统进化树 进化树中所用卵白的氨基酸序列的GenBank登录号:拟穴青蟹， KU644140.1;中华绒螯蟹， KF825558.1;棉铃虫， KU552106.1;好意思洲牡蛎， HM441076.1;日本鹌鹑， XM_015865743.1;皱纹盘鲍， MH135278.1;东说念主， NM_181054.2;鲢， HM146310.1;团头鲂， GU363498.1;虾夷扇贝， XM_021497943.1;小家鼠， BC026139.1;麦穗鱼， FJ794604.1;非洲爪蟾， NM_001086980.1. Fig.5 The phylogenetic tree based on the sequences of different SbHIF-1α family members The GenBank accession numbers of protein sequences used for phylogenetic analysis are as follows: Scylla paramamosain， KU644140.1; Eriocheir sinensis， KF825558.1; Helicoverpa armigera， KU552106.1; Crassostrea virginica， HM441076.1; Coturnix japonica， XM_015865743.1; Haliotis discus hannai ， MH135278.1; Homo sapiens， NM_181054.2; Hypophthalmichthys molitrix， HM146310.1; Megalobrama amblycephala， GU363498.1; Mizuhopecten yessoensis， XM_021497943.1; Mus musculus， BC026139.1; Pseudorasbora parva， FJ794604.1; Xenopus laevis， NM_001086980.1. 2.3 SbHIF-1α组织抒发分析

qRT-PCR检测 SbHIF-1α基因在血淋巴、鳃、外衣膜、斧足、闭壳肌和肝胰腺6个组织中的抒发效果如图 6所示。从图不错看出， 在所检测的6个组织中均能检测到SbHIF-1α的转录本， 血淋巴中抒发量最高， 鳃组织次之， 闭壳肌中最低。显贵性分析效果暴露， SbHIF-1α在外衣膜、闭壳肌、肝胰腺、斧足四个组织中的抒发量莫得显贵相反(P > 0.05)， 相对于闭壳肌， 血淋巴中抒发量是闭壳肌的11.45倍， 达到显贵相反(P < 0.05)， 鳃中的抒发量也达到相招架平(P < 0.05);同期， SbHIF-1α在血淋巴和鳃中的抒发量也有显贵相反。

图 6 SbHIF-1α在魁蚶不同组织中的抒发分散 a:血淋巴， b:鳃， c:外衣膜， d:斧足， e:闭壳肌， f:肝胰腺. 不同字母间暗意相反显贵(P < 0.05). Fig.6 Distribution of SbHIF-1α gene in different tissues of Scapharca broughtonii a: Haemocyte， b: Gill， c: Mantle， d: Foot， e: Adductor muscle， f: Hepatopancreas. Different letters indicate significant difference (P < 0.05). 2.4 SbHIF-1α在低氧威迫后各组织的抒发分析

SbHIF-1α在低氧威迫后各组织中的抒发变化如图 7所示。动作对照组， DO值为7.5 mg/L的对照组中SbHIF-1α基因在各组织的抒发量低且抒发融会。举座来看， 血淋巴(图 7A)和鳃(图 7B)中SbHIF-1α比拟其他组织反馈较为积极， 抒发量变化幅度也相对高于其他组织， 最高值诀别为对照组的519.43倍和124倍， 且抒发量随威迫时辰加多而总体升高。血淋巴中， 0.5 mg/L、2.5 mg/L的低氧威迫下， SbHIF-1α抒发随时辰延迟而冉冉加多， 4.5 mg/L组在36 h急剧高潮达到最高值后又快速回调。鳃中SbHIF-1α的抒发量趋势与血淋巴相似， 但威迫组在16 h时有个小的回调， 36 h初始显贵上调， 64 h达到最高值。而SbHIF-1α这种升高后镌汰再升高的变化趋势也体现外衣膜(图 7C)、斧足(图 7D)、闭壳肌(图 7E)和肝胰腺(图 7F)中， 不外这4个组织中SbHIF-1α的变化幅度相对于血淋巴和鳃小许多， 如0.5 mg/L现实组外衣膜、闭壳肌和肝胰腺中SbHIF-1α的最大值诀别是对照组的95.98倍、42.35倍和52.31倍。另外， 6个组织中SbHIF-1α对不同DO解决反馈进程具有一定的相似性， 随DO值镌汰即威迫进程的增强， SbHIF-1α反馈进程愈加热烈。如血淋巴中， 0.5 mg/L的低氧解决组相较2.5 mg/L和4.5 mg/L这两个低氧组反馈更积极， 相对抒发变化更大， 从威迫初始便积极反馈， 高潮趋势较2.5 mg/L和4.5 mg/L这两个低氧组更为显明， 显贵水平在4 h时就达到极显贵水平(P < 0.01)。

图 7 各组织SbHIF-1α在低氧威迫激后mRNA抒发水平变化 团结现实组不同字母暗意相反性极显贵(P < 0.01). Fig.7 SbHIF-1α mRNA expression level after hypoxia stress in various organizations Different letters in the same experimental group indicate highly significant difference (P < 0.01). 3 辩论

高级动物耐低氧才调差， 任何万古辰的缺氧皆会导致机体费事致使死亡[21]。关联词， 某些低等动物如海洋无脊椎动物照旧进化到在一段时辰内哄骗少许的氧气也不错存活[22]。为了应答缺氧取环境， 生物机体形成了一系列的调解机制， 其中HIF-1即是一种最主要的应答细胞内氧气浓度镌汰的转录因子成员之一， 不错对多种基因进行调控[23]。海洋软体动物中， 照旧有太平洋牡蛎[14]和杂色鲍[24]等HIF-1α基因被进行克隆和抒发估量。本估量通过PCR和RACE手艺克隆赢得了一种HIF-1α基因cDNA全长序列。序列和结构分析标明， SbHIF-1α具有与其他物种HIF-1α相似性较高的基因序列， 且领有HIF-1α基因保守的HLH、bHLH、PAS-A、PAS-B和PAC结构域， 这阐述SbHIF-1α基因在进化上保留了比较保守的结构域和功能位点[25]。不外， SbHIF-1α与其他物种的HIF-1α比拟也存在一定的相反。比如， 东说念主等高级动物以及节肢动物门中小长臂虾的HIF-1α中皆具有两个保守的脯氨酸羟化酶鸠合位点在[26-27]， 而SbHIF-1α只含有一个脯氨酸羟化酶鸠合位点LxxLAP， 但这与太平洋牡蛎[14]和杂色鲍[24]等近缘物种一致， 这可能是软体动物在HIF基因进化上形成的专有特色。魁蚶和栉孔扇贝HIF-1α两个基因的氨基酸序列相似度为90%， 序列相反不显明， 然则两种贝类的耐低氧才调相反显明[28]。据报说念， 从线虫到东说念主类， 低氧信号皆启动结构相易或相似的同源基因转录和调控， 并激活访佛的生理、生化反应[29]。是以变成不同贝类对氧气不同适合才调的原因可能是发生在HIF-1信号通路效应基因的判袂上， 这一效果与鱼类不同物种HIF-1基因相似而耐低氧才调差距大的效果相似[30]。

本估量中， 在血淋巴、外衣膜、鳃、斧足、肝胰腺和闭壳肌共6个组织中均检测到了SbHIF-1α基因转录本， 阐述了HIF分散的平生性， 这一效果也与HIF-1α在好意思洲牡蛎和蓝蟹(Callinectes sapidus)等水生无脊椎动物中各组织的抒发分散一致[31-32]。SbHIF-1α在闭壳肌中抒发量最低， SbHIF-1α在血淋巴中抒发量最高， 是闭壳肌的11.45倍， 其他组织的相对抒发量也皆比较低。Cai等[33]发现杂色鲍HIF-1α基因亦然在血淋巴和鳃中抒发量较高， 其他组织相对较低， 与本估量效果较为一致。不外， 好意思洲牡蛎、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)以及杂色鲍等其他水生无脊椎动物中HIF-1α均是在鳃组织中抒发量最高[31， 33-34]， 算计原因可能是魁蚶血淋巴比鳃在对外界刺激的细心方面推崇更弘远的作用， 赵庆[19]和黄永欢等[35]估量也暴露魁蚶的血淋巴在应答外界刺激应答中推崇较积极的作用。

本估量丰富了不同浓度低氧威迫下， 各个组织HIF-1α基因的抒发谱。魁蚶受到低氧威迫时， HIF-1α在各组织中均作念出实时反应。血淋巴受较强低氧威迫后SbHIF-1α的抒发量变化总体趋势是冉冉升高， 且溶氧越低的现实组对威迫反馈更积极， 高潮趋势较更为显明， 0.5 mg/L现实组在4 h时就达到极显贵水平(P < 0.01)。这阐述魁蚶HIF-1α在低氧威迫初期到低氧威迫的通盘这个词经过皆在推崇弘远的作用， 这一丝与Cai等[33]估量效果一致， 而本估量更全面地分析了不同低氧条目下及更长解决时辰下HIF-1α的抒发限定。本估量中鳃、外衣膜、斧足、闭壳肌和肝胰腺组织低氧威迫使各解决组 SbHIF-1α的抒发量变化的总体趋势基本是升高后镌汰再高潮的趋势， 这一效果与照旧估量的太平洋牡蛎、凡纳滨对以及杂色鲍等水无邪物的干系估量效果有一定判袂[31， 33]， 这阐述与其他其他海洋软体动物比拟， 魁蚶可能具有一套特别的耐低氧适合机制， 算计与其含有红细胞联系， 干系机理还需进一步估量。导致这一变化趋势的原因可能是机体受到低氧刺激后， SbHIF-1α积极反馈后与HIF-1β基因相鸠合进一要领控卑鄙基因， 从而抒发量先减少。然则由于更高强度的低氧威迫可能使机体需要更多的适合调控来应答， 是以SbHIF-1α基因在各组织中的抒发量会赓续高潮以对机体进行更多方面的适合性调控。上述变化趋势与魁蚶铁卵白基因在受到外界刺激后的变化趋势一致[36]， 算计这两个基因受到外界环境威迫后的调解机制相似。本估量开展了SbHIF-1α在外衣膜、斧足、闭壳肌和肝胰腺组织在低氧威迫下转录水平的估量， 卵白质水平的反馈限定还有待进一步进行。

当今， 对于HIF-1的估量多麇集在哺乳类上， 而贝类HIF-1的估量相对较少。而HIF-1动作机体调解氧均衡的主要转录因子丝袜 英语， 在呼吸调解和应答外界刺激的免疫细心方面推崇作用， 仍有许多后续潜入估量亟待开展。本估量初步揭示了魁蚶HIF-1α基因的结构特征和抒发形式， 为魁蚶HIF-1信号通路和低氧适合机制估量提供了参考。